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干货贴|高分辨质谱Orbitrap直击靶标代谢组学新热点

发布:赛默飞世尔科技(中国)有限公司
浏览次数:187

在生命科学奇妙世界里,基因、核酸、蛋白和小分子代谢产物构成了细胞生命活动的基本要素,以这些物质为基础的诸多组学技术的发展,推动着生命科学研究不断向前。

 

基因-蛋白-代谢-表型之间的互动成为生命科学研究中研究的范式¹,研究成果可谓精妙纷呈、大放异彩。

图1:基因-蛋白-代谢-表型之间的互动成为生命科学研究中研究的范式¹

 

代谢组学和脂质组学研究

其中代谢物处于“中心法则”的终端,既可提供生物表型的外在表现信息,又可反过来调节基因组、转录组和蛋白质组的水平来影响细胞的生理功能。代谢组学及脂质组学从提出至今,已迅速发展成为系统生物学的重要组成部分,在代谢性疾病、阿尔兹海默症、糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝及肿瘤等疾病相关研究中发挥着重要作用。

 

作为生物体内重要的功能物质之一,脂质具有多种生物学功能,与细胞凋亡、信号传导、疾病感染、免疫功能, 以及胎儿代谢缺陷等都密切相关。“十三五”规划、重大项目指南等均将脂质列为重点研究内容,近期多篇文章均发现脂类代谢发生了重要改变²³,其研究受到越来越多的关注。

 

已知的潜在生物标志物多来源于氨基酸、酰基肉碱、神经递质、脂类等。作为生物标志物和疾病机制研究中重要内容和目标,如何在对代谢物实现流程标准化和定量化的基础上,最大限度地提高代谢物的检测种类和数量,以更加全面真实地反映机体在内外因素扰动下代谢状态的变化,是目前代谢组学分析技术面临的最大挑战之一。

 

赛默飞和合作伙伴公司合作推出的AbsoluteIDQ p400 HR Kit,在标准化和定量化上迈出了重要的一步。我们在Q Exactive Plus 和TSQ Altis上均验证了此方法,可满足不同检测需求:

左图为Q Exactive™ Plus 组合型四极杆Orbitrap™ 质谱仪;右图为TSQ Altis™三重四极杆质谱仪

 

检测指标:

低至10μL基质样品,最多可检测408种代谢物,包括氨基酸、生物胺类、酰基肉碱以及脂类;

 

产品优势:

基于标准品和稳定同位素内标建立,定量结果准确可靠;样品处理流程标准化、通量化;

 

检测方法:

Q Exactive 系列超高分辨质谱检测,检测指标更多更全,特异性更强;

 

严格质控:

附带Start kit及系统适用性测试kit,并采用QC样本精确质控;

 

图3:氨基酸、生物胺类、脂类等11类化合物信息

 

氨基酸和生物胺定量分析

针对氨基酸和生物胺类物质极性大、某些代谢物含量低、基质复杂等问题,采用衍生化试剂进行衍生,稳定同位素标记化合物作为内标的方法成为解决这些问题行之有效的研究策略。我们采用异硫氰酸苯酯作为衍生化处理,研究血浆中41种氨基酸和生物胺类代谢物。

 

结果发现,这种方法不但增强了代谢物的保留行为,获得良好的色谱峰形,同时灵敏度也得到了提升,下图为41种代谢物的提取离子流图。 

图4 血浆中41种小分子代谢物提取离子流图

脂质定量分析

脂类代谢物因其结构上的不同,NIH将之分为磷脂、鞘脂、甘油酯、胆固醇等八大类。同类代谢物在质谱上往往具有类似的特性,研究者利用这一特点开发出一种有效的分析方法,利用稳定同位素标记的内标来定量一类脂质,方法简单可靠。

采用这种方法,可准确定性定量NIST 1950标准血浆中 215种脂类信息,包含酰基肉碱类、甘油磷脂类、鞘脂类、神经酰胺、甘油酯等。本方法适用于血浆、血清、尿液、组织样本中的检测,最多可检测到365种脂类成分,大部分脂类QC准确度在90~110%之间,符合生物样品定量分析的需求

图5:酰基肉碱类QC 准确度

表1 NIST 1950标准血浆中可检测到的脂类信息

多中心验证实验

前文我们提到,代谢组学要想全面进入临床医学和健康产业的服务领域,需要花大力气解决技术平台的行业标准化问题。赛默飞公司的研究者作出了大胆的尝试,努力为各领域的研究者保驾护航。

我们在Q Exactive 系列平台上开展了一项多中心的Ring-trial。该实验由全球5个国家和地区的14个实验室参与,共分为2个阶段:

第一阶段

由各实验室人员采用AbsoluteIDQ p400 HR Kit试剂盒独立进行样品前处理和数据采集;

第二阶段

12批次样品的双盲实验,该实验旨在提供数据说明,同一批次样品在不同研究中心、操作人员、仪器平台的测试结果的可重现性

 

多中心实验室开展的研究结果表明, 各实验室间的结果具有较好的重现性,氨基酸和生物胺类代谢物偏差RSD<25%.

 

目前靶标代谢组学的研究中,串联四极杆质谱是最常用的技术之一。随着高分辨质谱技术的发展,采用高分辨质谱同时定性定量的方式显示出来独特的优势。以Orbitrap为代表的超高分辨质谱在灵敏度、线性范围、精密度等方面已能媲美串联四极杆质谱。

因此,基于高分辨质谱定量技术正日益成为包括靶向代谢组学在内的生物样品分析的研究热点。

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2019-06-12 10:54:30